HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南：控制pH值

由于離子化化合物的保留對流動相pH非常敏感，因此需要添加緩沖液來控制流動相的pH值。
當添加少量酸或堿時，緩沖液會保持pH值。HPLC緩沖液中使用了許多不同的物質；部分添加劑會在表1中列出。

在pKa值上下浮動1個pH單位內使用時，緩沖液是最有效的；在pKa值上下浮動2個pH單位時，也可提供足夠的緩沖。

表1. 常見的流動相添加劑1的pKa值

pKa (25°C)	化合物
0.3 2.15 3.13 3.75 4.76 4.76 4.86 6.35 6.40 7.20 8.06 9.23 9.25 9.78 10.33 10.72 11.27 12.33	三氟乙酸2 磷酸(pK1) 檸檬酸(pK1) 甲酸 醋酸 檸檬酸(pK2) 丙酸 碳酸(pK1) 檸檬酸(pK3) 磷酸(pK2) 三異丙基乙磺酰 硼酸 氨 甘氨酸(pK2) 碳酸(pK2) 三乙胺 吡咯烷3 磷酸(pK3)

1 [1]的數據；2 默克索引；3 CRC物理化學手冊

HPLC紫外檢測最常用的緩沖液是磷酸鹽和醋酸鹽。

磷酸鹽和醋酸鹽是非常有用的緩沖液，因為它們可以在低于220nm的波長下使用。

從表2可以看出，磷酸鹽具有三個pKa值，可提供如下三個緩沖范圍：1.1<pH<3.1，6.2<pH<8.2和11.3<pH<13.3（pKa可上下浮動1個pH單位）。

由于色譜柱的穩定性在實際使用時存在限制因素，我們需要將較低范圍截斷至2.0<pH <3.1，并消除最高范圍。

請注意，磷酸鹽的緩沖作用在pH為3.1和pH為6.2之間存在一個缺口。

這意味著，雖然可以將磷酸鹽的pH值調節至5.0，但這個pH值下的緩沖能力可以忽略不計。

為了填補這個緩沖缺口，就需要另一種緩沖液。

由于醋酸鹽的緩沖范圍為3.8<pH<5.8，因此它剛好可以填補這一缺口。

如果略微擴展pKa的緩沖范圍（上下浮動1個pH單位），磷酸鹽和醋酸鹽便可以覆蓋通常用于硅基色譜柱的整個pH范圍，即2<pH<8。

有時在方法開發過程中，您可能希望在色譜柱的有效范圍內完全控制pH值。

在這種情況下，磷酸鹽和和醋酸鹽混合物可使流動相在2<pH<8的范圍內連續變化。

一旦發現所需的pH值，就可以去掉不需要的緩沖液。

例如，如果最終流動相的pH值是4.3，那么醋酸鹽就是所需的緩沖液，根本無需使用磷酸鹽。
部分分析人員喜歡使用檸檬酸鹽，因為它具有三個重疊的pKa值，可在2.1<pH<6.4的范圍內提供緩沖（表2）。

但是，檸檬酸鹽并不像醋酸鹽和磷酸鹽那樣具有較低的紫外截止波長，所以它無法在220nm以下的波長環境下工作。

此外，一些分析人員發現，在使用檸檬酸鹽時，止回閥會出現更多的問題。

因此，檸檬酸鹽緩沖液通常是位于磷酸鹽和醋酸鹽之后的第二選擇。

表2. 常見的HPLC緩沖液

緩沖液	pH范圍	LC-MS 兼容性
磷酸鹽(pK1) 磷酸鹽(pK2) 磷酸鹽(pK3) 醋酸鹽1 檸檬酸鹽(pK1) 檸檬酸鹽(pK2) 檸檬酸鹽(pK3) 三氟乙酸(0.1%) 磷酸(0.1%) 甲酸(0.1%) 甲酸銨 碳酸氫銨 硼酸鹽	1.1 – 3.1 6.2 – 8.2 11.3 – 13.3 3.8 – 5.8 2.1 – 4.1 3.7 – 5.7 4.4 – 6.4 2.0 2.0 2.7 2.7 – 4.7 6.6 – 8.6 8.3 -10.3	X X X 是 X X X 是 X 是 是 是 是

1 適用于LC-MS的醋酸銨